Cara kerja spektrofotometri UV-Vis

       Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan pembanding, misalnya blangko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok 200nm-650nm (650nm-1100nm) agar daerah λ yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup “nol” galvanometer didapat dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan, buka fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blangko dan “nol” galvanometer didapat dengan memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakan tombol transmitansi, kemudian atur besarnya pada 100%. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi:
1. Sumber tenaga radiasi yang stabil
2. Sistem yang terdiri dari lensa-lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain
3. Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal
4. Tempat culikan yang transparan
5. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan system meter atau pencatat

Diagram sederhana dari spektrofotometer adalah sebagai berikut
(1) Sumber Tenaga Radiasi
      Sumber tenaga radiasi terdiri dari benda yang tereksitasi hingga ke tingkat tenaga yang tinggi oleh sumber listrik bertegangan tinggi atau oleh pemanasan listrik. Benda atau materi yang kembali ke tingkat tenaga yang lebih rendah atau ke tingkat dasarnya, melepaskan foton dengan tenaga-tenaga yang karakteristik yang sesuai dengan ΔE, yaitu perbedaan tenaga antara tingkat tereksitasi dan tingkat dasar rendah.
      Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus menghasilkan spektrum kotinu dengan intensitas yang seragam pada keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang dipelajari.
a. Sumber Radiasi Ultraviolet
       Sumber-sumber radiasi ultraviolet yang kebanyakan digunakan adalah lampu hydrogen dan lampu deuterium. Mereka terdiri dari sepasang elektroda yang terslubung dalam tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan yang rendah. Bila tegangan yang tinggi dikenakan pada elektroda-elektroda, maka akan dihasilkan electron-elektron yang mengeksitasikan electron-elektron lain dalam molekul gas ke tingkatan tenaga yang tinggi. Bila electron-elektron kembali ke tingkat dasar mereka melepaskan radiasi dalam daerah sekitar 180 dan 350 nm. Sumber radiasi UV yang lain adalah lampu xenon, tetapi dia tidak sestabil lampu hydrogen.
b. Sumber Radiasi Terlihat
      Sumber radiasi terlihat dan radiasi infra merah dekat yang biasa digunakan adalah lampu filament tungsten. Filament dipanaskan oleh sumber arus searah (DC), atau oleh baterai. Filament tungsten menghasilkan radiasi kontinu dalam daerah antara 350 dan 2500 nm.
(2). Monokromator
       Seperti kita ketahui bahwa sumber radiasi yang umum digunakan menghasilkan radiasi kontinu dalam kisaran panjang gelombang yang lebar. Dalam spektrofotometer, radiasi yang polikromatik ini harus diubah menjadi radiasi monokromatik. Ada 2 jenis alat yang digunakan untuk mengurai radiasi polikromatik menjadi radiasi monokromatik yaitu penyaring dan monokromator. Penyaring dibuat dari benda khusus yang hanya meneruskan radiasi pada daerah panjang gelombang tertentu dan menyerap radiasi dari panjang gelombang yang lain. Monokromator merupakan serangkaian alat optic yang menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif/panjang gelombang-gelombang tunggalnya dan memisahkan panjang gelombang-gelombang tersebut menjadi jalur-jalur yang sangat sempit.
(3). Tempat cuplikan
      Cuplikan yang akan dipelajari pada daerah ultraviolet atau terlihat yang biasanya berupa gas atau larutan ditempatkan dalam sel atau cuvet. Untuk daerah ultraviolet biasanya digunakan Quartz atau sel dari silika yang dilebur, sedangkan untuk daerah terlihat digunakan gelas biasa atau Quartz. Sel yang digunakan untuk cuplikan yang berupa gas mempunyai panjang dari 0,1 hingga 100 nm, sedang sel untuk larutan mempunyai panjang lintasan tertentu dari 1 hingga 10 c,. sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air, atau jika dikehendaki dapat dicuci dengan larutan deterjen atau asam nitrat panas.
(4). Detektor
      Peranan detector penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Pada spektrofotometer, tabung pengganda electron yang digunakan prinsip kerjanya telah diuraikan.Setiap detector menyerap tenaga foton yang mengennainya dan mengubah tenaga tersebut untuk dapat diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik atau perubahan-perubahan panas. Kebanyakan detector menghasilkan sinyal listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat. Setiap pencatat harus menghasilkan sinyal yang secara kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang mengenainya.
Persyaratan-persyaratan penting untuk detector meliputi :
1. Sensitivitas tinggi hingga dapat mendeteksi tenaga cahaya yang mempunyai tingkatan rendah sekalipun
2. Waktu respon pendek
3. Stabilitas yang panjang/lama untuk menjamin respoon secara kuantitatif
4. Sinyal elektronik yang mudah diperjelas.